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反相色譜柱柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關注。反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式。反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相。